Действующим началом препарата фоспренил, который обладает широким спектром биологической активности (гепатопротекторной, ранозаживляющей, антидиабетической и др.), являются фосфаты полипренолов (ФП). Одной из наиболее привлекательных и актуальных для практической ветеринарии (и медицины) сторон является противовирусная активность фоспренила. Другим перспективным для лечебной практики направлением является иммуномодулирующая активность фоспренила, применение ФП в качестве адъюванта для противовирусных вакцин.

Механизмы противовирусного действия фоспренила окончательно не изучены. Это объясняется полифункциональной активностью и комплексным действием фоспренила при вирусной инфекции, как на организм в целом (включая клетки иммунной системы), так и на клеточном уровне, включая: 1) клетки иммунной системы, 2) клетки-мишени для вирусов. В настоящем разделе мы хотели бы обратить внимание специалистов на целесообразность использования фоспренила в качестве профилактического и лечебного противовирусного средства, и обобщить имеющиеся данные, касающиеся механизмов его действия как иммуномодулятора, так и препарата, обладающего, по-видимому, прямым противовирусным эффектом.

Действие фоспренила как иммунокорректора вторичных иммунодефицитов

К числу ведущих факторов, вызывающих в организме животных вторичный иммунодефицит (невозможность или снижение способности иммунной системы адекватно отвечать на инфицирование организма патогенами различной природы, в том числе и вирусами или, например, сформировать вакцинальный иммунитет), относится стресс. Известно, что при современной жизни, животные постоянно подвергаются воздействию множества стресс-факторов (стрессоров), как физических (климатические условия, изменения экологической обстановки, загрязнение окружающей среды, антигенная нагрузка, состав воды и пищи, транспортировка, тренировочные нагрузки, травмы и др.), так и психогенных (смена или потеря хозяина, скученность при содержании на ограниченной площади и др.).

В многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях, начиная с 60-х годов и кончая современными было показано, что стресс вызывает в организме человека и животных иммуносупрессию: 1) снижает количество циркулирующих Т- и В-лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, иммуноглобулинов; 2) подавляет первичный и вторичный иммунный ответ к различным антигенам; значительно снижает абсолютное число и фагоцитирующую активность макрофагов селезенки; 3) снижает цитотоксическую активность естественных киллеров и макрофагов; 4) подавляет способность клеток продуцировать a-, b- и g-интерферон и, напротив, способствует увеличению продукции некоторых цитокинов (ИЛ-1b, ФНО-a). На фоне стресс-индуцированного иммунодефицита в организме животных наблюдаются возникновение и отягощение течения целого ряда вирусных инфекций, активация латентных вирусных инфекций, а также подавление развития специфического иммунного ответа при вакцинации. При этом сама по себе перенесенная или латентная вирусная инфекция является фактором, вызывающим формирование иммунодефицитных состояний, на фоне которых могут развиваться осложнения в виде секундарных и оппортунистических инфекций, ослабленная реакция на вакцинацию. Вторичный иммунодефицит могут вызывать многие вирусы, в т.ч. вирусы, играющие важную роль в инфекционной патологии животных (парвовирусы, герпесвирусы, ретровирусы, реовирусы и др.)

Действие вышеперечисленных факторов объясняет пониженную сопротивляемость животных к вирусным инфекциям и снижение эффективности вакцинации. Все это обосновывает целесообразность разработки и внедрения высокоэффективных иммунокорректоров. Несмотря на то, что в современной клинической и экспериментальной практике широко используются десятки природных и синтетических иммуномодуляторов (олексин, ридостин, иммунофан, полиоксидоний, неовир, лейкинферон, циклоферон, ронколейкин – рекомбинантный ИЛ-2, беталейкин – рекомбинантный ИЛ-1b, гликопин, вилон, тимоген. и др.), их применение ограничивается рядом факторов, и лишь крайне немногие из них обладают прямым противовирусным эффектом.

В наших экспериментальных исследованиях убедительно показано, что фоспренил, зарегистрированный в РФ как противовирусный препарат (А.В.Санин и соавт., 1991), является эффективным иммунокорректором вторичных иммунодефицитов, индуцированных различными внешними факторами: вирусной инфекцией, стрессом, радиацией. Например, однократное внутримышечное введение фоспренила мышам в дозе 5 мкг за короткий срок полностью восстанавливает специализированные функции антителообразующих В-клеток (АОК), значительно сниженные вследствие вирус- или стресс-индуцированного иммунодефицита (Данилов Л.Л. и соавт.,1999). В экспериментах на мышах, подвергавшихся радиационному воздействию в дозе 900 рад, выявлена эффективность применения фоспренила в качестве корректора функций стволовых клеток костного мозга (СККМ). У облученных контрольных животных отмечали полное подавление пролиферации СККМ, тогда как у облученных мышей, которым однократно перорально или внутримышечно вводили ФП в дозе 0,4 мкг регистрировали значительное увеличение способности СККМ к пролиферации.

Исходя из накопленных фактов, можно предположить, что механизм иммунокорригирующей способности фоспренила, по-видимому, состоит в следующем. Эндогенные фосфаты полипренолов участвуют в биосинтезе N-гликановых цепей гликопротеинов, к которым относятся, в частности, все виды иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgM), g- и b- интерфероны, поверхностные антигены и практически все рецепторы клеточной поверхности. Вполне вероятно, что при вторичных иммунодефицитах в клетках наблюдается недостаток эндогенных фосфатов полипренолов, поэтому введение в организм дополнительных ФП нормализует физиологию и функции иммунокомпетентных клеток, в том числе АОК. Одним из возможных механизмов устранения с помощью фоспренила клеточного дисбаланса, наблюдаемого при вторичном иммунодефиците, по-видимому, является выброс в кровь СККМ при инъекциях животным фоспренила. С другой стороны, известно, что ФП являются интегральным компонентами клеточных мембран и влияют на многие их свойства (текучесть, проницаемость и т.д.). Логично предположить, что введение в организм экзогенных ФП способствует восстановлению как структур клеток (нарушенных в результате цитотоксического действия гормонов стресса и глюкокортикоидов или при других неблагоприятных воздействиях, например, при вирусных инфекциях), так и их способности к пролиферации.

Таким образом, фоспренил может быть использован в ветеринарной практике в качестве высокоэффективного антистрессорного препарата и иммунокорректора. Важно отметить, что фоспренил имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими препаратами: 1) не является ксенобиотиком; 2) не является антигеном; 3)действует на организм комплексно: не стимулируя избирательно какое-либо одно из звеньев гуморального или клеточного иммунитета, а способствует нормальному функционированию клеток иммунной системы организма в целом; 4) фоспренил может использоваться в качестве неспецифического профилактического противовирусного средства и при этом, в отличие от специфических сывороток и иммуноглобулинов, не имеет ограничений во времени применения. Здесь уместно подчеркнуть, что использование сывороток и иммуноглобулинов высокоэффективно лишь на ранних стадиях инфекционного вирусного процесса. Сыворотки эффективно работают против вируса тогда, когда вирус находится в крови. Это продолжается примерно 5-7 дней после начала заболевания. Когда вирус "уходит" в ткани, эффективность применения сывороток резко падает. На поздних сроках применение таких препаратов может вызвать развитие ряда иммунопатологических реакций и осложнить течение инфекции. Например, при экспериментальном клещевом энцефалите было установлено, что антитела (в определенных титрах) могут индуцировать повреждающее действие макрофагов во второй половине инкубационного периода (Хозинский В.В., Семёнов Б.Ф., 1999).

Фоспренил, кроме того, зарекомендовал себя как высокоэффективный адъювант. Например, в опытах с инактивированной коммерческой вакциной против клещевого энцефалита автором было показано, что вакцина, непосредственно разведенная не обычным растворителем, а фоспренилом, увеличивает свою специфическую активность в 8-10 раз. Использование фоспренила как адъюванта противовирусных вакцин значительно повысит эффективность вакцинации, особенно в тех случаях, когда у животного выявлен или подозревается вторичный иммунодефицит. Доказано, что фоспренил значительно стимулирует формирование и напряженность вакцинального иммунитета у собак при совместном его введении с антирабической вакциной (Аржаев А.М. и соавт., 1999).

Фоспренил – неспецифический иммуномодулятор при вирусных инфекциях

В экспериментальных исследованиях, проведенных А.В.Саниным, А.Н.Наровлянским, О.Ю.Сосновской, А.В.Прониным, А.В.Деевой и др. в опытах in vivo и in vitro удалось убедительно доказать, что фоспренил обладает широким спектром биологической активности, в частности влияет на функционирование иммунной системы, гемопоэтической и системы естественной резистентности (A.V.Sanin, e.a.,1992; A.V.Sanin, e.a.,1993; L.L.Danilov e.a., 1997). Одним из механизмов стимуляции фоспренилом системы естественной резистентности организма является индукция выработки эндогенных интерферонов (ИФН). Например, в опытах на мышах линии СВА показано, что при внутрибрюшинном однократном введении фоспренила в дозах 40 и 200 мкг/мышь регистрировалась индукция ИФН в сыворотке крови через 2 часа, причем уровень ИФН сохранялся повышенным до 72 часов после введения препарата, достигая 256 ЕД , в то время как у контрольных животных – 0 ЕД. В опытах in vitro было исследовано влияние ФП на действие стандартных индукторов ИФН: ридостина, неовира – камедона (индукторов ИФН-a и ИФН-b), стафиллококкового энтеротоксина А (СЭА), определяющего способость клеток к синтезу ИФН-g. Эксперименты на мышах показали, что предварительное введение фоспренила в дозе 5 мкг/ мышь приводит к усилению активности применяемых впоследствии ридостина и неовира. В опытах на клетках мышиных фибробластов L929 было установлено, что фоспренил увеличивает неовир- и ридостин- индуцированную продукцию ИФН-a/b. Кроме того, показано, что фоспренил модулирует активность иммукомпетентных клеток тимуса, селезенки, стимулируя ИФН-ответ на стандартные индукторы ИФН и способствуя повышению ИФН-активирующей способности сыворотки и плазмы крови.

Показано, что фоспренил способен стимулировать в организме животных продукцию некоторых цитокинов, играющих ключевую роль в развитии гуморального и клеточного иммунного ответа при вирусной инфекции. Так, на мышах линии С57Вl/6 установлено, что фоспренил, введенный животным однократно в дозах 1 или 4 мкг, внутримышечно или перорально, индуцирует продукцию ФНО до уровня 30-50 ЕД. При внутримышечном введении фоспренила мышам линии BALB/c отмечали 3-6-кратную стимуляцию ИЛ-1 через 24 часа. Пероральное введение препарата животным приводило к стимуляции ИЛ-1 в 1,6 раза по сравнению с контролем через 7 суток. Все эти данные были получены на незараженных вирусами животных. Возникает вопрос: как реализуется механизм противовирусного действия фоспренила в организме инфицированного вирусом животного? Для ответа на этот вопрос мы провели серию опытов, моделируя у мышей инфекцию, вызываемую вирусом клещевого энцефалита (Ожерелков С.В., Тимофеев А.В., Новикова Г.П и др., 2000). Нам удалось установить, при одновременном введении в организм животных вируса и препарата выживает до 60% мышей, тогда как заражённые вирусом необработанные ФП мыши заболевают и гибнут в 100 % случаев через 7-9 суток после заражения вирусом.

Мы провели обследование сывороток крови животных, которым вводили ФП и вирус, а также заражённых мышей, которым ФП не вводили. С помощью иммуноферментного метода определяли уровни цитокинов ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-a, ИФН-g и ИЛ-2 на 1-е, 2-е, 3-и, 4-е, 5-е, 6-е и 7-е сутки после заражения, т.е. в течение всего инкубационного периода до начала проявления клинических признаков клещевого энцефалита (парезов и параличей с последующей гибелью). В те же сроки определяли уровни цитокинов у мышей, которым вводили только препарат без вируса, а также у животных, которых заражали вирусом, но не вводили ФП. Результаты исследований показали, что введение препарата животным, не заражённым вирусом, приводит к повышению уровней ИЛ-5, ИЛ-6 и ИФН-g через 24, 48 и 72 часа после введения препарата соответственно. При этом у таких животных не не наблюдалось стимуляции продукции ИЛ-10, ИЛ-2 и ФНО-a. В сыворотках крови животных, которым вводили вирус и ФП уровень ИЛ-6 значительно повышался уже на 1-е сутки, а стимуляция ФНО-a, ИФН-g регистрировалась на 3-и сутки после заражения и введения препарата, но не выявляли стимуляции продукции ИЛ-2 в указанные сроки. Такую раннюю стимуляцию не наблюдали ни у животных, которым вводили только препарат, ни у мышей, которых заражали вирусом. Так, у мышей, инфицированных вирусом, но не получавшим препарат, стимуляцию продукции ИЛ-10 и ИЛ-5 регистрировали через 24 часа, а ИЛ-6 и ИФН-g лишь через 96 часов после заражения. При этом не наблюдали стимуляции ИЛ-2 и ФНО-a в указанные сроки. В сыворотках крови животных, заражённых вирусом, но не получавших ФП, на фоне развития клинических признаков клещевого энцефалита (на 7-е сутки после заражения) регистрировали высокие уровни ИЛ-6, ИФН-g и ФНО-a, но не выявляли стимуляции ИЛ-2. У мышей, инфицированных вирусом и получавших ФП, на 7-е сутки после заражения и введения препарата также регистрировали повышенные уровни ИЛ-6, ИФН-g и ФНО-a, однако в значительно меньших количествах, чем у инокулированных вирусом, но не получавших ФП животных. Полученные данные, на наш взгляд, свидетельствуют о том, при попадании в организм патогена (в данном случае вируса) фоспренил дополнительно стимулирует моноциты и макрофаги, которые продуцируют цитокины , стимулирующие дифференцировку (ИЛ-6), пролиферацию (ИЛ-5) В-клеток и секрецию антител к вирусу (ИЛ-6).

Кроме того, ФНО-a обладает цитотоксичностью для вирусинфицированных клеток. Аналогичной способностью обладает и ИФН-g. Так в общих чертах выглядит механизм антивирусной активности ФП, реализующийся посредством его иммуномодулирующей активности. Важно отметить, что у животных, заражённых вирусом, но не получавших препарата, в период развития клинических признаков заболевания (на 7-е сутки после заражения) регистрировали высокие уровни цитокинов ИЛ-6, ИФН-g и ФНО-a. Однако это не вызывало защиту животных от вирусной инфекции ни в одном случае. Полученные данные полностью согласуются с современными представлениями о том, что слишком высокие уровни цитокинов играют повреждающую роль: могут отягощать течение инфекционного процесса, а также вызывать шок и смерть организма-хозяина.

Полученные нами данные на модели инфекции, вызываемой вирусом клещевого энцефалита согласуются с результатами, полученными Iida J.et al. (1990), которые показали, что химически синтезированный полипренол – дегидрогептапренол (ДГП) в дозе 200 мкг, веденный интраназально дважды – за 3 дня и за 1 день до заражения, значительно повышает устойчивость мышей к инфекции, вызываемой вирусом Сендай. При этом у животных, обработанных ДГП и зараженных вирусом отмечали значительное повышение продукции интерферона и ФНО по сравнению с мышами, которым вводили только препарат или только вирус.

Экспериментальные данные, полученные нами в последнее время, выявили ещё одно свойство фоспренила: проявлять свою антивирусную активность непосредственно в головном мозге. Оказалось, что если препарат вводить одновременно с вирусом клещевого энцефалита в головной мозг 2-3-х дневных сосунков беспородных мышей, то титры инфекционного вируса в ЦНС таких животных снижаются в 1000 раз по сравнению с таковыми у мышей, которым интрацеребрально вводили вирус без препарата. Таким образом, фоспренил является одним из оптимальных для ветеринарной практики иммуномодуляторов, так как введённый в организм, в котором отсутствует патоген (например, вирус), препарат, по-видимому, не вызывает избыточной стимуляции иммунной системы, которая, как известно, может приводить к развитию целого ряда патологических реакций и повредить организму. В случае угрозы развития вирусной инфекции применение ФП вызывает оптимальную «раннюю» стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета, что и позволяет организму своевременно защититься от инфекции. Кроме того, препарат в силу своей химической природы обладает способностью восстановить структуру и функции клеток иммунной системы (и не только клеток иммунной системы), повреждённых в результате вирусной инфекции. Хорошо известно, что многие вирусы активно размножаются в иммунокомпетентных клетках и могут длительно сохраняться в них (персистировать). Некоторые вирусные гены, имея сходство с генами хозяина, облегчают репликацию вируса. Например, крупные ДНК-содержащие вирусы (герпесвирусы, аденовирусы, поксвирусы) имеют в своём геноме целый ряд генов, которые кодируют белки, используемые вирусами для противодействия иммунным реакциям организма (эти гены были, по-видимому, захвачены вирусами в процессе эволюции и модифицированы в пользу вирусов). Многие вирусы обладают способностью нейтрализовывать активность ряда цитокинов, играющих ключевую роль в развитии противовирусного иммунного ответа (ИФН, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-2, ИЛ-4) и тем самым вызывать в организме иммуносупрессию. Использование ФП в профилактических и лечебных целях при вирусных инфекциях позволяет, на наш взгляд, предотвращать развитие вирусиндуцированной иммуносупрессии.

Следует особо подчеркнуть, что успешное применение ФП (как и других иммуномодуляторов) зависит от целого ряда важных обстоятельств. Во-первых, от особенностей патогенеза той или иной вирусной инфекции. Роль клеточного и гуморального иммунитета, специфические формы взаимодействия вируса с клетками иммунной системы (как и с основными клетками-мишенями для вируса) при многих вирусных инфекциях остаются неизученными. Во-вторых, механизмы иммуномодулирующего действия фоспренила (учитывая широкий спектр биологической активности препарата) также находятся в процессе изучения.

Но даже в тех случаях, когда патогенез вирусных инфекций изучен достаточно детально (например, динамика размножения вируса в клетках-мишенях, особенности иммунного ответа, динамика появления противовирусных антител, в частности - IgM, IgG, IgA - в крови больных животных) и, казалось бы, можно смело рекомендовать применение тех или иных иммуномодуляторов в зависимости от направленности их действия на иммунную систему организма-хозяина, тем не менее, применять их необходимо с определенной осторожностью. В этом случае фоспренил не является исключением из правила. Например, авторитетный специалист в области инфекционных болезней животных П.Е.Игнатов, исходя из знаний особенностей патогенеза ряда вирусных инфекций собак, дает обоснованные рекомендации по применению иммуномодуляторов, оптимальных для каждой из вирусных инфекций. Так, при парвовирусном энтерите – комплексные препараты, стимулирующие фагоциты (особенно печени) и В-систему, при аденовирусном гепатите и ларинготрахеите предпочтительно применение стимуляторов фагоцитов, а при чуме плотоядных в основном рекомендуется применение стимуляторов В-системы, а лечение стимуляторами системы Т-хелперов и макрофагов эффективно лишь на ранних стадиях развития инфекции. Фоспренил определенно относится к комплексным иммуномодуляторам, поэтому следовало бы ожидать наибольшего успеха при лечении с его помощью парвовирусного энтерита собак или панлейкопении кошек (также вызываемой парвовирусом). И, в свою очередь - значительно меньшего эффекта при лечении чумы плотоядных. Однако широкая практика применения фоспренила в качестве средства этиотропной терапии вирусных инфекций собак и кошек показала, что наилучший результат лечения достигается как раз при чуме плотоядных у собак. При этом фоспренил успешно используется как на ранних, так и на более поздних сроках развития инфекции, причем при различных формах заболевания (даже при нервной форме чумы) у собак различных пород и возрастов (Деева А.В. и соавт., 1998). Лечение ФП парвовирусного энтерита собак и панлейкопении кошек может быть значительно менее эффективно. Аналогичная картина наблюдается при лечении фоспренилом инфекционного гепатита и ларинготрахеита собак, вызываемых аденовирусами.

Почему это происходит? Прежде всего, это можно объяснить особенностями патогенеза каждой вирусной инфекции. Так, парвовирусный энтерит характеризуется быстрым течением инфекции: максимальные титры вируса в крови и фекалиях обнаруживаются уже на 3-4-е сутки после инфицирования, а противовирусные антитела - лишь на 5-7-е сутки. При этом задолго до того, как успевает сформироваться адекватный иммунный ответ, у больного животного оказываются пораженными вирусом жизненно важные органы: обширно поражаются уже на 2-й день после экспериментального заражения лимфоузлы, тимус, селезенка, тонкий отдел кишечника. Поэтому лечебный иммуномодулирующий эффект фоспренила (как и многих других препаратов, за исключением специфических сывороток) может попросту не успеть вовремя реализоваться. Иная картина наблюдается при инфицировании организма вирусом чумы плотоядных. Развитие специфического иммунного ответа регистрируется уже на 3-5-е сутки, при этом стимулируется Т- и В-система иммунитета. Течение этой инфекции характеризуется интенсивным размножением вируса в макрофагах, Т- и В-лимфоцитах и, как следствие этого – развитие в организме больного животного иммуносупрессии. В этой связи успешное лечение фоспренилом чумы плотоядных может объясняться предотвращением развития вирусиндуцированной иммуносупрессии или ее коррекцией при применении препарата. Другим важным обстоятельством является тот факт, что фоспренил наряду с иммуномодулирующей активностью (ряд особенностей которой до сих пор интенсивно изучаются) обладает прямым противовирусным действием и эффект этого действия зависит от строения вируса. В наших экспериментальных исследованиях было четко показано, что фоспренил значительно подавляет размножение вируса чумы плотоядных в чувствительной культуре клеток СПЭВ и, напротив, не оказывает противовирусного действия in vitro в отношении парвовируса (по данным, полученным специалистами ВГНКИ А.А.Ольшанской и др.) и аденовируса (см. Таблицу 1).

Таким образом, логично предположить, что при чуме плотоядных фоспренил действует двояко: с одной стороны как иммуномодулятор, а с другой – как препарат, способный напрямую подавлять размножение вируса в органах и тканях больного животного. Таким комплексным воздействием фоспренила на вирусную инфекцию можно объяснить успехи в лечении чумы плотоядных, и напротив - определенные трудности в лечении инфекций, вызываемых парво- и аденовирусами.

Прямое противовирусное действие ФП. Механизмы протективного эффекта препарата на стадиях взаимодействия вирус-клетка

Под прямым противовирусным действием ФП мы понимаем непосредственное нарушение препаратом одной или нескольких основных фаз жизненного цикла вирусов: неспецифическое связывание ФП с вирионами вне клетки, препятствие ФП сорбции вируса на клетку (блокирование клеточных рецепторов на мембране), нарушение репликации и сборки вирусных частиц внутри клетки, препятствие выходу вирионов из клетки.

В экспериментальных исследованиях in vitro нам удалось выявить способность ФП подавлять размножение целого ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов, играющих важную роль в патогенезе заболеваний животных и человека (Ожерелков С.В. и др., 2001) .

В Таблице 1 представлены данные о противовирусном действии ФП in vitro в отношении вирусов, играющих важную роль в инфекционной патологии домашних и сельскохозяйственных животных.

Таблица 1. Противовирусная активность фоспренила

Прежде всего отметим, что сам факт противовирусного действия ФП in vitro в отношении ДНК- и РНК- содержащих вирусов свидетельствует о наличии у фоспренила способности нарушать одну или несколько фаз жизненного цикла этих вирусов. Возникает вопрос : на каком этапе (или этапах) взаимодействия вирус-клетка проявляется антивирусное действие препарата? Необходимо отметить, что выявить эти этапы представляет сложную проблему. Как видно из данных, приведенных в Таблице 1 разница между титрами вирусов в контроле и опыте колеблется от сравнительно небольшой (10-кратное подавление размножения вируса болезни Ауески в чувствительной культуре клеток) до значительной (фоспренил снижает титры вирусов чумы плотоядных и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота более чем в 100 раз). Заметим, что среди специалистов вирусологов в таких опытах значительной считается разница от 1,5 lg (30-кратное подавление размножения вируса) и более.

В ходе экспериментов мы выявили следующую закономерность: если в культуру клеток сначала добавлять необходимую количество ФП (как правило, 200 мкг на 1 мл), затем оставлять клетки контактировать с препаратом в течение разных промежутков времени (1 час, 2 часа, 24 часа или 48 часов), а затем заражать вирусом, то никакой разницы в титрах вируса между контролем и опытом не выявлялось. Логично предположить, что препарат не действует на этапе сорбции вируса на клетки и не блокирует её специфические для вируса рецепторы. Противовирусный эффект препарата проявлялся лишь в тех случаях, когда вирус и ФП вносили в культуру одновременно (или предварительно в течение непродолжительного времени 0,5 часа инкубировали вирус с препаратом).

Исходя из полученных результатов нами была выдвинута гипотеза о том, что ФП взаимодействует с вирионами вне клетки. Для проверки этой гипотезы мы провели серию экспериментов, используя реакцию прямой гемагглютинации. Эта методика была выбрана нами, исходя из следующего: было обнаружено, что ФП обладает выраженной дозозависимой гемагглютинирующей активностью в отношении эритроцитов гуся (ЭГ) и не обладает таковой в отношении эритроцитов собаки или кошки. Давно известно, что вирус клещевого энцефалита агглютинирует ЭГ, поэтому реакция торможения гемагглютинации в присутствии противовирусных антител широко используется для определения титров антител к вирусу. В многократно повторённых экспериментах мы показали, что ФП блокирует гемагглютинирующую активность вируса (так и наоборот: вирус тормозит гемагглютинацию ЭГ фоспренилом). Полученные данные, на наш взгляд, подтвердили гипотезу о том, что фоспренил может взаимодействовать с вирионами вне клетки, по-видимому, образуя устойчивые комплексы ФП-вирус, и тем самым препятствовать заражению чувствительных клеток. Однако этот механизм прямого противовирусного действия ФП - не единственный.

Другая выявленная нами закономерность состояла в следующем: во всех опытах (вне зависимости от того, какой вирус был объектом исследований и какая культура клеток использовалась для размножения вирусов) проявление цитопатогенного действия вируса в культуре в присутствии ФП всегда регистрировалось на 24-48 часов позднее, чем в контрольных заражённых клетках даже при высоких дозах вируса. Этот факт, по нашему мнению, с одной стороны подтверждает возможность реализации механизма действия ФП против вирусов вне клетки: образование комплексов ФП-вирус. С другой стороны возможно противовирусное действие ФП внутри клетки. Например, не изменяет ли препарат вирулентность урожая вируса? Для ответа на этот вопрос мы протитровали урожай вне- и внутриклеточного вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота: а) контрольный, то есть полученный без внесения ФП и б) экспериментальный, полученный на культуре, которую заражали вирусом в присутствии фоспренила на свежей культуре клеток. Оказалось, что титр урожая вируса во всех контрольных пробах значительно выше, чем в таковых, которых заражали вирусом в присутствии препарата. Причём эта разница отчётливо выявлялась как пробах, исходно заражённых высокими дозами вируса, где первичное проявление ЦПД визуально в световом инвертированном микроскопе выглядело одинаково в контроле и опыте, так и в пробах, инфицированных более низкими дозами. Суммарно титры урожая вируса, полученного в клетках на фоне действия препарата, были на 3-4 lg меньше, чем урожай контрольного вируса. Этот факт свидетельствует о другом механизме прямого противовирусного эффекта препарата. Одним из объяснений этого факта может служить предположение, что на фоне действия ФП внутри клетки часть вирионов формируются дефектными (неспособными заражать другие клетки). Частичным подтверждением этого предположения могут быть предварительные данные исследования урожая вируса клещевого энцефалита, полученные методом электронной микроскопии. Так, было установлено что среди вирусных частиц в урожае (после действия ФП) встречается множество вирионов с разрыхлённой оболочкой и без оболочки. Почему же вирионы под воздействием Фоспренила формируются дефектными? Точного ответа на этот вопрос пока нет. Однако существуют несколько гипотез, которые в данный момент находятся в стадии экспериментальной проверки.

Другим объяснением существенного снижения вирулентности урожая вируса при воздействии фоспренила является возможная (опосредованная вирусами) стимуляция препаратом интерферона (или других внутриклеточных вирусных ингибиторов). Здесь уместно напомнить данные, приведённые выше: при одновременном введении в организм животного вируса и ФП наблюдается значительная стимуляция ИФН. При этом реализация такого механизма противовирусного действия ФП зависит с одной стороны от культуры клеток, а с другой – от структуры и особенностей внутриклеточного цикла размножения вируса. Экспериментальное подтверждение существования такого механизма антивирусного действия ФП смогло бы объяснить некоторые на первый взгляд противоречия, полученные в опытах in vitro (см. Таблицу 1).

Почему фоспренил в такой разной степени снижает размножение «близкородственных» (принадлежащих к одному и тому же семейству Herpesviridae) вирусов – вируса болезни Ауески в 10 раз,а вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота более, чем в 100 раз? В первом случае титрование вируса проводилось на первичной культуре куриных фибробластов, во втором – на перевиваемой культуре клеток почек телёнка (Таурус 1). Если предположить, что фоспренил, внесённый в культуру клеток вместе с вирусом, способен каким-то образом трансформировать клеточный метаболизм и стимулировать синтез интерферона, то разница в степени противовирусной активности ФП в отношении этих вирусов объяснялась бы различной способностью этих культур клеток продуцировать интерферон. Аналогичным образом можно было бы объяснить существенные различия противовирусного действия препарата в отношении других вирусов, полученных на разных культурах клеток: каждая культура клеток в различной степени способна под влиянием препарата синтезировать интерферон. Здесь необходимо отметить следующий интересный факт: визуально культуры клеток после внесения Фоспренила выглядят несколько иначе, чем контрольные, необработанные препаратом.

В последнее время нами было экспериментально доказано, что Фоспренил значительно снижает вирулентность общего урожая вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в культуре клеток Таурус-1. При этом показано, что одним из механизмов противовирусной активности Фоспренила на этапах взаимодействия вирус-клетка является стимуляция препаратом клеточного ИФН (Таблица 2).

Таблица 2. Стимуляция Фоспренилом интерферона в культуре клеток Таурус-1, заражённой вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, при одновременном внесении в клетки вируса и препарата.

Фоспренил не влияет на размножение в клетках безоболочечных вирусов: вируса полиомиелита и аденовируса крупного рогатого скота. При этом не наблюдается изменений вирулентности общего урожая аденовируса в культуре клеток Таурус-1 и не регистрируется повышение уровня ИФН в клетках, заражённых аденовирусом. Таким образом, нами была экспериментально подтверждена гипотеза, что одним из механизмов противовирусной активности Фоспренила на этапах взаимодействия вирус-клетка является стимуляция препаратом общего клеточного интерферона.

Ещё одна особенность противовирусной активности препарата на этапах взаимодействия вирус-клетка отчётливо прослеживается в данных, приведённых в Таблице 1: прямое противовирусное действие ФП проявляется только в отношении вирусов, содержащих внешнюю оболочку. Так, нами не было выявлено никакой противовирусной активности ФП в отношении аденовируса крупного рогатого скота (штамм В-10).Однако имеются данные, что Фоспренил способен подавлять размножение аденовируса собак 2-го типа in vitro (Danilov L.L. et. al, 1997).

Чем можно объяснить различия в полученных данных? С одной стороны результаты были получены на разных культурах клеток, а это обстоятельство может иметь значение, если подтвердится гипотеза о способности ФП стимулировать интерферон в определённых культурах клеток. С другой стороны, в опытах с аденовирусом крупного рогатого скота мы определяли способность ФП предотвращать размножение вируса по проявлению ЦПД в культуре. В экспериментах с аденовирусом собак различия были выявлены по способности вируса образовывать в культуре клеток бляшки, а данный метод включает нанесение на культуру клеток агарового покрытия. Не исключено, что агаровое покрытие увеличило контакт Фоспренила с культурой клеток и тем самым усилило его действие. Подобное объяснение косвенно подтверждается данными, полученными в опытах in vivo: оказалось, что если ФП вводить в составе желатиновых капсул (примерный аналог агара), противовирусное действие препарата значительно увеличивается (Pronin A.V., е.а., 1996).

Данные, приведённые в настоящем разделе, явно свидетельствуют о способности препарата комплексно и разновариантно действовать против вирусной инфекции, как на уровне целого организма (иммуномодуляция), так и на уровне взаимодействия вирусов с клетками-мишенями: связываться с вирусами вне клеток, препятствуя сорбции последних на клеточных рецепторах, стимулировать синтез интерферона внутри клеток, не исключено, что фоспренил нарушает сборку вирионов на уровне гликозилирования вирусных белков внутри клетки (прямое противовирусное действие). При этом, в зависимости от конкретной вирусной инфекции, в организме животных Фоспренил может осуществлять защитное действие, как оптимальный иммуномодулятор - в случаях инфекций, вызываемых безоболочечными вирусами, а в случаях инфицирования организма вирусами, содержащими внешнюю оболочку – двояко: и как иммуномодулятор, и как препарат прямого противовирусного действия. Какой из этих двух механизмов противовирусного действия ФП оказывается решающим – предстоит выяснить в ходе дальнейших экспериментальных и клинических исследований.

Литература

1. Аржаев А.М., Ожерелков С.В., Данилов Л.Л., Деева А.В., Мальцев С.Д., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Санин А.В. Препарат Фоспренил стимулирует вакцинальный иммунитет у собак при совместном введении с антирабической вакциной // В сб.: Материалы второй межрегиональной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе». - 27 мая 1999 года, пос. Персиановский.- С.6.

2. Данилов Л.Л., Деева А.В., Мальцев С.Д., Наровлянский А.Н., Ожерелков С.В., Пронин А.В., Санин А.В., Сосновская О.Ю. Средство для профилактики и лечения инфекционных заболеваний и коррекции патологических состояний живого организма // Патент на изобретение № 2129867, 10 мая 1999, RU 2129867.- C1.1998.

3. Деева А.В., Ожерелков С.В., Новиков А.Ю., Данилов Л.Л., Мальцев С.Д., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Санин А.В.. Фоспренил – противовирусный препарат широкого спектра действия // Журн. Ветеринар. – 1998.- №3.- С.15-21.

4. Игнатов П.Е. Очерки об инфекционных болезнях у собак.- Москва,1995. С.19-39, 91-92.

5. Ожерелков С.В., Тимофеев А.В., Новикова Г.П., Деева А.В., Наровлянский А.Н., Санин А.В., Пронин А.В.. Защитное действие нового противовирусного препарата Фоспренил при экспериментальном клещевом энцефалите // Вопр. Вирусол.- 2000.- Т.45.-№ 1.-С.33-37.

6. Ожерелков С.В., Белоусова Р.В., Данилов Л.Л., Деева А.В., Мальцев С.Д., Наровлянский А.Н., Санин А.В., Пронин А.В. Препарат Фоспренил подавляет размножение вирусов диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в чувствительных культурах клеток //Вопр.вирусол.-2001 , -Т.5. С. 43-45.

7. Ожерелков С.В., Сосновская Ю.А., Красота А.Ю., Деева А.В., Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Белоусова Р.В.: Особенности противовирусной активности Фоспренила в отношении вирусов домашних и сельскохозяйственных животных// В Сб.: Тезисы Региональной Конференции по актуальным проблемам ветеринарной мелких домашних животных. - “Золотая Осень Кубани – 2001” 5-6 октября 2001, г. Краснодар., С.44 – 45.

8. Санин А.В., Данилов Л.Л., Мальцев С.Д., Сосновская О.Ю., Моисеенков А.М., Прозоровский С.В., Шибаев В.Н., Веселовский В.В., Насташенко Т.А., Мисуренко Н.К. Противовирусное средство. А.с.N5004524 от 18.10.91, патент RU2038083С1.

9. Хозинский В.В., Семёнов Б.Ф.: Иммунопатология при экспериментальном клещевом энцефалите, В сб.: Материалы конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва 23-25 ноября 1999 г., Т.2, С.47.

10. Danilov L.L., Maltsev S.D., Deyeva A.V., Narovlyansky A.N., Sanin A.V., Ozherelkov S.V. and Pronin A.V. Phosprenyl : A Novel Drug with Antiviral and Immunomodulatory Activity// Arch.Immunol.Ther.Exp.-1997.-Vol.44.- P. 395 – 400.

11. Рronin A.V,.Sanin A.V,.Deyeva A, Antiрov Y., Sachek M., Рanko S.. Deрot-form of рhosрhoрolyрrenols as рrotective remedy for influenza. "Oрtions for the control of influenza". Conf.Cairns, North Queensland, Australia 4-9 May 1996, Р.1-11.

12. A.V.Sanin, L.L.Danilov, S.D.Maltsev, A.N.Narovlyansky, O.G.Lysyuk, O.S.Merimskaya, T.A.Nikolaeva, O.Yu.Sosnovskaya, T.N.Kuzina, T.A.Nastaschenko. New immunomodulators of natural origin for theraрy of acute viral infections. Abstr.International Immunol. Congr., Budaрest, Hungary,1992.

13. Sanin A.V, Danilov L.L., Maltsev S.D.,.Narovlyansky A.N., Nastashenko T.A., Sosnovskaya O.Yu. Study of the рhosрhorilated isoрrenoids as novel anti HIV-1 comрounds with a рotent antiviral activity. Abstr.IX International Conference on AIDS, Berlin, June 1993. Abstr.No.4593.